Polylinker

Il sito multiplo di clonaggio (in inglese polylinker o multiple cloning site, MCS) è una regione del plasmide nella quale può essere inserito un DNA esterno (10-11Kb). Molto utile in esperimenti di biologia molecolare. Questo DNA può essere inserito grazie all'aiuto di enzimi particolari, detti enzimi di restrizione. Questi enzimi agiscono a livello di una sequenza specifica, detta sito di restrizione, riconoscendola e applicando un taglio al filamento di DNA, generando o estremità appiccicose (sticky ends) o estremità nette (blunt ends). All'interno del MCS ci sono siti per circa 21 enzimi di restrizione. I polylinkers trovano applicazione nelle tecniche del DNA ricombinante. In particolare, vengono utilizzati al fine di inserire un cDNA (DNA copiato da mRNA) all'interno del vettore (es plasmide).La tecnica prevede i seguenti step: 1. * ) Aggiunta dei polylinkers ad entrambe le estremità del cDNA, in presenza di ligasi (non ligasi eucariotica poiché non è in grado di saldare doppie eliche, ma solo singoli filamenti; si utilizza ligasi del fago T4 che invece riforma il legame fosfodiesterico a livello di doppia elica) 2. * ) Utilizzo un enzima di restrizione per la sequenza di interesse contenuta nei polylinkers, oltre che nel vettore. Ottengo in questo modo estremità appiccicose, sticky ends.